Дискусы.

Вестник Тверского государственного университета. Серия "Биология и экология". 2021. No 4 (64)

ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА
В ЭПИДЕРМАЛЬНОМ СЕКРЕТЕ КОРМЯЩИХ ДИСКУСОВ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ВЫКАРМЛИВАЕМОГО ПОТОМСТВА*

О.В. Саная1, Г.И. Пронина1, А.О. Ревякин2

Лактоферрин – это многофункциональный белок, который принимает участие в иммунной системе, обладает антибактериальной, противогрибковой, противовирусной и противопаразитарной активностью. Встречается у млекопитающих в секреторных жидкостях эпидермального происхождения. Данные о наличии лактоферрина у более низших животных отсутствуют. Сделано предположение, что представители семейства Цихлиды, выкармливающие личинок секретом собственного тела, могут создавать колостральный иммунитет у потомства. Ранние исследования кожного секрета дискусов показали наличие в нём компонентов схожих с молоком млекопитающих. Исследовали корреляцию содержания лактоферрина в эпидермальном секрете и крови кормящих дискусов, а также влияние количества лактоферрина в эпидермальном секрете родительских пар на выживаемость потомства в личиночной стадии. Лактоферрин определяли методом иммуноферментного анализа. В эпидермальном секрете дискусов обнаружен лактоферрин, при повышении его концентрации в кожной слизи наблюдается снижение концентрации в крови. Родительские пары дискусов с высоким уровнем лактоферрина в эпидермальным секрете реже уничтожали кладки икры и личинок, также наблюдалось большее количество принятых личинок. Выявлено, что повышенный уровень лактоферрина в эпидермальным секрете кормящих дискусов достоверно увеличивает выживаемость личинок.

Введение. Лактоферрин – полифункциональный негемосодержащий железосвязывающий белок из семейства трансферринов широко представлен в различных секреторных жидкостях, таких как молоко, слюна, слёзы, секреты носовых желез. Лактоферрин является одним из компонентов иммунной системы организма, принимает участие в системе неспецифического гуморального иммунитета, регулирует функции иммунокомпетентных клеток и является белком острой фазы воспаления. Помимо индукции системного иммунитета, лактоферрин может стимулировать кожный иммунитет и ингибировать аллергические реакции (Gonzalez-Chavez et al., 2009; Николаев, Сухарев, 2015; Mayeur et al., 2016).
Установлено, что лактоферрин обладает антибактериальной, противогрибковой, противовирусной и противопаразитарной активностью.

Антимикробное действие лактоферрина обусловлено двумя разными механизмами: связывание свободного железа бактерий, необходимого для их роста, и прямое взаимодействие лактоферрина с липополисахаридом бактериальных стенок. Лактоферрин может повреждать бактерии за счет образования пероксидов, катализируемых ионами лактоферрин-связанного железа (III), влияя на проницаемость мембраны и приводя к лизису бактериальных клеток (Bennett, Kokocinski, 2005). С другой стороны, лактоферрин способствует росту бактерий с низкой потребностью в железе, таких как Lactobacillus и Bifidobacteria, которые обычно считаются полезными для хозяина (Sherman et al., 2004; Gianasanti et al., 2016).

Противогрибковое действие лактоферрина заключается в дестабилизации мембран; при этом иммуномодуляция и секвестрация железа играют второстепенные роли (Valenti, Antonini, 2005; Fernandes, Carter, 2017). Лактоферрин проявляет мощную противовирусную активность как против вирусов в оболочке, так и против вирусов без оболочки (Pietrantoni et al., 2010; Wakabayashi et al., 2014).

Противопаразитарная активность лактоферрина связана с нарушением усвоения железа некоторыми паразитами (Giansanti et al., 2013).

Считается общепринятым, что лактоферрин является ключевым фактором врожденного иммунитета млекопитающих (в том числе человека) (Legrand, Mazurier, 2010).

Лактоферрин защищает новорождённого от патогенных микроорганизмов до тех пор, пока не заработает его собственный иммунитет. Однако имеющиеся данные относятся исключительно к млекопитающим, у которых происходит передача белка от матери к потомству вместе с молозивом и молоком. Вместе с тем отсутствуют данные о приобретении пассивного иммунитета у более низших животных. Изучив данный вопрос, было отмечено что у некоторых видов рыб семейства Цихлиды, мальки поедают секрет с тела родителей. Нами было сделано предположение, что по аналогии с молоком млекопитающих, обеспечивающим колостральный иммунитет, в секрете кормящих цихлид помимо питательных веществ могут содержаться источники пассивного иммунитета. Для проверки этой гипотезы был проведен эксперимент на рыбах дискусах, представителях семейства Цихлиды.

Дискусы (Symphysodon haraldi) являются интересным объектом изучения передачи иммунных свойств от родителей потомству, так как личинка питается эпидермальным секретом родителей. Некоторые полезные компоненты слизи дискуса, которые передаются личинкам, аналогичны компонентам молока млекопитающих: иммуноглобулины, лектины, гормоны, ионы, аминокислоты и антитела (Chong et al., 2005; Khong et al., 2009). Интересно, что многие из этих компонентов (пролактин, иммуноглобулины и специфические белки) значительно увеличиваются в кожной слизи во время размножения (Sylvain, Derome, 2017; Zhang et al., 2021). Вместе с тем исследований по содержанию лактоферрина в эпидермальном секрете дискусов в доступной литературе нами не найдено.

Цель – определение содержания лактоферрина в эпидермальном секрете кормящих дискусов и его влияние на выживаемость выкармливаемого потомства.

Методика. Объектами исследований являлись родительские пары кормящих дискусов (Symphysodon haraldi), возраст 1,5-2 года и их потомство в личиночной стадии в период вскармливания эпидермальным секретом.
По массе и размерам тела рыбы достоверно не различались между собой. Родительские пары дискусов содержались в 100- литровых аквариумах с аэрацией и фильтрацией по принципу аэрлифта, в нем рыбы нерестились на вертикальный субстрат и выкармливали личинку до перехода на самостоятельное питание, в возрасте 2-х недель (рис. 1).
В опытную группу отбирались пары с уровнем лактоферрина в эпидермальном секрете выше 100 нг/мл (6 пар n=12). В контроль подбирались пары со значениями показателя ниже 100 нг/мл (6 пар n=12).

Пробы брали in vivo у кормящих самцов и самок. Эпидермальный секрет получали in vivo спонжем, затем переносили в шприц и выдавливали в пробирку (Chong et al., 2005). Лактоферрин в эпидермальном секрете и плазме крови рыб определялся методом иммуноферментного анализа c использованием наборов ELISA (LTF) на cпектрофотометре MultiScan Go.
Кровь для анализа отбирали из хвостовой вены шприцом с добавлением гепарина на льду, затем переносили в пробирку.

Для получения плазмы пробирки с кровью центрифугировали при температуре +4°C 1500 об/мин в течение 15 минут. После отбора и переноса плазмы в свежие пробирки ее снова центрифугировали при тех же условиях. Готовые образцы хранили в полипропиленовых пробирках при температуре -70°C. Выживаемость личинок определяли у каждой пары дискусов методом подсчета в момент выклева личинок и после снятия с родителей самостоятельно питающихся мальков.
Математическую обработку цифровых материалов проводили методом вариационной статистики по Стьюденту с использованием компьютерной обработки данных Достоверными считались различия при Р
Результаты и обсуждение. Впервые было констатировано наличие лактоферрина в эпидермальном секрете дискусов, что подтверждает нашу гипотезу о сходстве компонентов и иммунных свойств эпидермальной слизи кормящих дискусов с молоком млекопитающих. А также, возможно, о передаче иммунитета от родителей потомству.
Отмечено, что в крови опытных дискусов уровень лактоферрина в крови достоверно ниже, чем в контроле (при повышении его концентрации в кожной слизи наблюдается снижение концентрации в крови (таблица). По данным показателям выявлена обратная корреляция с коэффициентом равном -0,79.

Выявлено, что у дискусов с высоким уровнем лактоферрина в
эпидермальном секрете (опытная группа) меньше уничтоженных кладок и больше выращенных и высаженных пометов, чем у родительских пар с низким уровнем лактоферрина в кожном секрете (таблица).
Кроме того, в опытной группе наблюдалось достоверно большее количество выращенных личинок с одного помета.
По-видимому, эпидермальный секрет кормящих дискусов помимо питательной ценности обладает адаптогенными свойствами и повышает защитные механизмы иммунитета у личинок, что может быть связано с в т.ч. с входящим в его состав лактоферрином, который, как было отмечено выше, обладает противомикробными , противовирусными противогрибковыми свойствами и предположительно, через усиление иммунитета на выживаемость выкармливаемых личинок. Полученные данные позволяют по-новому взглянуть на эволюцию механизмов, увеличивающих способность к выживанию, в т.ч пассивного иммунитета и использовать дискусов в качестве модели для более глубокого изучения данного вопроса.

Заключение. В эпидермальном секрете кормящих дискусов также как в молоке млекопитающих содержится лактоферрин.
Повышенный уровень лактоферрина в эпидермальном секрете кормящих дискусов достоверно увеличивает выживаемость личинки.
Полученные результаты позволят ближе подойти к пониманию фундаментальных основ эволюционного развития, так как рыбы (цихлиды), находясь на более низкой ступени, предположительно раньше млекопитающих перешли на вскармливание потомства, тем самым повысив их выживаемость.
Дискусы являются удобной и адекватной моделью для изучения эволюционных взаимоотношений по вопросам вскармливания потомства, влиянии различных факторов на выживаемость потомства, с возможностью экстраполяции полученных результатов на других животных и, возможно, человека, а также филогенетической прослеживаемости изучаемых вопросов.

Список литературы.

Николаев А.А., Сухарев А.Е. 2015. Лактоферрин и его роль в репродукции (обзор литературы) // Проблемы репродукции. No 6. С. 25-30.

Bennett R.M., Kokocinski T. 2005. Lactoferrin content of peripheral blood cells // British journal of Haematology. V. 39. P. 509-521.

Chong K., Ying T. S., Foo J., Jin L. T., Chong A. 2005. Characterization of proteins in epidermal mucus of discus fish (Symphysodon spp.) during parental phase // Aquaculture. V. 249. P. 469-476.

Esteban M A., Rodríguez A., Meseguer C., José A. 2005. Effects of lactoferrin on non-specific immune responses of gilthead seabream (Sparus auratus L.) // Fish & shellfish immunology. V. 18(2). P. 109-124.

Fernandes K.E., Carter D.A. 2017. The antifungal activity of lactoferrin and its derived peptides: mechanisms of action and synergy with drugs against fungal pathogens // Frontiers in Microbiology. V. 8(2).

Giansanti F., Leboffe L., D’Elia I., Antonini G. 2013. An update on the antifungal activities of Lactoferrin: New promising applications in diagnostic, therapeutics and biotechnology // Anti-Infective Agents in Medicinal Chemistry. V. 11. P. 155-158.

Giansanti F., Panella G., Leboffe L., Antonini G. 2016. Lactoferrin from milk: nutraceutical and pharmacological properties // Pharmaceuticals (Basel). V. 9(4). P. 61.

Gonzalez-Chavez S. A., Arevalo-Gallegos S., Rascon-Cruz Q. 2009. Lactoferrin: structure, function and applications // International Journal of Antimicrobial Agents. V. 33(4). P. 301.e1-8.

Khong H.K., Kuah M. K., Jaya-Ram A., Shu-Chien A.C. 2009. Prolactin receptor mRNA is upregulated in discus fish (Symphysodon aequifasciata) skin during parental phase // Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. V. 153 P. 18-28.

Legrand D., Mazurier J. 2010. A critical review of the roles of host lactoferrin in immunity // Biometals. V. 23. P. 365-376.

Mayeur S., Spahis S., Pouliot Y., Levy E. 2016. Lactoferrin, a pleiotropic protein in health and disease // Antioxid Redox Signal. V. 24. P. 813-836.

Pietrantoni A., Dofrelli E., Tinari A., Ammendolia M.G., Puzelli S., Fabiani C., Donatelli I., Superti F. 2010.

Bovine lactoferrin inhibits influenza a virus induced programmed cell death in vitro // Biometals. V. 23. P. 465-475.

Sherman M.P., Bennett S.H., Hwang F.F., Yu C. 2004. Neonatal small bowel epithelia: Enhancing anti-bacterial defense with lactoferrin and Lactobacillus GG // Biometals. V. 17. P. 285-289.

Sylvain F., Derome N. 2017. Vertically and horizontally transmitted microbial symbionts shape the gut microbiota ontogenesis of a skin-mucus feeding discus fish progeny // Scientific Reports. V. 7(1). P. 52-63.

Valenti P., Antonini G. 2005. Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack // Cellular and Molecular Life Sciences. V. 62. P. 2576-2587.

Wakabayashi H., Oda H., Yamauchi K., Abe F. 2014. Lactoferrin for prevention of common viral infections // Journal of Infection and Chemotherapy. V. 20. P. 666-671.

Zhang Y., Wen B., Meng L.-J., Gao J.-Z., Chen Zh.-Zh. 2021. Dynamic changes of gut microbiota of discus fish (Symphysodon haraldi) at different feeding stages // Aquaculture. V. 531. P. 735-912.


Об авторах:

САНАЯ Ольга Владимировна – аспирант кафедры аквакультур и пчеловодства, ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет – МСXА им. К.А. Тимирязеваeва», 127434, Москва, ул. Тимирязевская, 49; e-mail: discus2020@gmail.com.

ПРОНИНА Галина Иозеповна – доктор биологических наук, доцент кафедры аквакультур и пчеловодства, ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет – МСXА им. К.А. Тимирязева», 127434, Москва, ул. Тимирязевская, 49; e-mail: gidrobiont4@yandex.ru.

РЕВЯКИН Артем Олегович – кандидат биологических наук, ООО ИЦ «Фармоборона», 141074, Московская область, Королев, ул. Гагарина, 46А; e-mail: ar_info@mail.ru.
-------------------------------------------------------------------------------------

Так почему же в аквакультуре дискусов, уже традиционно, поддерживаются высокие температуры воды +29+31С (а то и +33С)?

Продолжение следует... .


Изменено 24.2.24 автор mocej

Для начала посмотрим на места и условия обитания дискусов.
Обратите внимание на состояние плавников, жаберных крышек и внешних покровов.






















Продолжение следует...

Как видим, почти все дискусы поражены "плавниковой гнилью".
Люди производящие отлов и занимающиеся последующей передержкой, констатируют постоянное наличие жаберных сосальщиков и бактериальные инфекции, спутники дискусов в природе.
Вода изобилует "паразитами", в том числе жгутиконосцы Spironucleus, вызывающие Гексамитоз (спиронуклеоз или октомитоз) - паразитарное заболевание. Или Дипломонады - одноклеточные жгутиконосцы Spironucleus, обитающие в окружающей среде. Распространенное название Флагеллаты, а само заболевание носит так же "народное название Дырчатая или Дырочная".

Так что же позволяет дискусам выживать в таких условия?

1. Иммунитет.
Иммуните́т (лат. immunitas — освобождение) человека и животных — способность организма поддерживать свою биологическую индивидуальность путём распознавания и удаления чужеродных веществ и клеток (в том числе болезнетворных бактерий и вирусов, а также собственных видоизменённых опухолевых клеток). Характеризуется изменением функциональной активности преимущественно иммуноцитов с целью поддержания антигенного гомеостаза внутренней среды.
Иммунитет в организме обеспечивает иммунная система.
Ярилин А. А. Большая российская энциклопедия М. : Большая российская энциклопедия.

2. Иммунный ответ.
Иммунный ответ - сложная многокомпонентная, кооперативная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном, уже распознанным как чужеродный, и направленная на его элиминацию. Явление иммунного ответа лежит в основе иммунитета.
Иммунный ответ зависит от:
антигена - свойства, состав, молекулярная масса, доза, кратность попадания, длительность контакта;
состояния организма (иммунологическая реактивность);
условий внешней среды.
Воrg Hacker, Jürgen Heesemann. Molekulare Infektionsbiologie.

3. Наличие хищников.
Рассмотрим это на доступном примере травоядных.
Что говорит биология об отношениях хищник-жертва? Действительно ли так необходимы хищники в природных биосистемах?
Это действительно так. Экологическая роль "хищник" важна в пищевой цепи, которая начинается с растений и заканчивается организмами, разрушающими мертвую органику до неорганических веществ. Упрощенно цепь выглядит так: растения -> травоядные животные -> хищные животные -> бактерии и грибы.
Выражаясь в терминах экологии: продуценты - консументы I порядка - консументы II порядка - редуценты.
В случае выпадения из пищевой цепи хищных животных, они же консументы II-го порядка, кажется, что ничего страшного не произойдет. Травоядные начнут жить припеваючи. Спокойно щипать травку, а гибнуть в следствие естественных причин. Редуценты получат свое в любом случае.
Однако поскольку травоядные продолжат размножаться в том же темпе, что и раньше, вскоре их будет слишком много в биосистеме. Ведь их больше не едят хищники. И тут возникают две проблемы:
Травоядные выедают растительность, которая не успевает восстанавливаться. Пищи на всех не хватает, животные ослабевают. Их иммунитет не справляется с болезнями, которые раньше бы с легкость подавил.
В слишком плотной популяции быстро распространяются инфекционные заболевания. Даже при наличии пищи подобные явления приводят к массовой гибели животных.
Таким образом, хищники играют важную экологическую роль. Контролируя численность травоядных, они не дают им полностью уничтожать растения - их основной пищевой ресурс.
Также хищники играют эволюционную роль, так как чаще поедают слабых и неприспособленных к конкретным условиям среды особей, чем здоровых и приспособленных.
(С)Биологический репетитор.

Итак, рыбы уже у нас в аквакультуре, условия обитания не соответствую природным.
Приведение параметров воды в соответствие с природными нам доступно, все остальное нет.
По выше описанным причинам - падение иммунитета и иммунного ответа.
В том числе, снижение концентрации Лактоферрина в крови и эпидермальном секрете дискусов, а в период нереста и выкармливания, снижение концентрации Лактоферрина в крови еще больше.
Добавим к этому.
Длительное содержание дискусов в аквакультуре.
Инбридинг - скрещивание близкородственных форм в пределах одной популяции.
Тысячи, десятки тысяч, сотни тысяч гибридов, распространившихся в аквакультуре.
И как результат, все тоже - падение иммунитета и иммунного ответа.
В том числе, снижение концентрации Лактоферрина в крови и эпидермальном секрете дискусов, а в период нереста и выкармливания, снижение концентрации Лактоферрина в крови еще больше.

Продолжение следует...

И снова все тот же вопрос.
Так почему же в аквакультуре дискусов, уже традиционно, поддерживаются высокие температуры воды +29+31С (а то и +33С)?

Коммерческая аквакультура и энтузиасты от аквариумистики дошли до этого совоим умом и накопленным опытом.
Повышение температуры воды, в ряде случаев, давно практикуется аквариумистами.
Ускоряются обменные процессы, "метаболизм" и все тоже увеличение концентрации Лактоферрина в крови и эпидермальном секрете дискусов, что и повышает иммунитет, и иммунный ответ.

- Живут ли дискусы более короткую жизнь в таких условия искусственного "ускорения"?
- Нет!
Максимальная продолжительность жизни дискуса в дикой природе (известная мне), около 4,5 лет.
Максимальная продолжительность жизни дискуса в аквакультуре при повышенных температурах (известная мне), около 6,5 лет.

- Можно ли содержать дискусов при более низких температурах, в травниках и тп.?
- Конечно можно, это всего лишь хобби, просто нужно понимать, что в этих случаях дискус заведомо не достигнет своего максимального размера, заложенного его генетикой. Вероятность различных заболеваний значительно выше.

Можем ли мы как то помочь дискусам?
Что говорит современная наука?

Продолжение следует... .

ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКА СУБТИЛИС-С НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ И ИММУННЫЙ СТАТУС РЫБ СЕМЕЙСТВА ЦИХЛОВЫЕ&

Пронина Г.И., Саная О.В., Черкалин А.И.

РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва, Российская Федерация&

При интенсивном разведении рыб усиливается воздействие стресс-факторов, провоцирующих снижение общей резистентности. Применение иммуномодуляторов способствуют усилению иммунной устойчивости организма. Цихловые представляют ценность как объекты аквакультуры: тиляпия – неприхотливая в выращивании товарная рыба с высокими потребительскими качествами; дискус – популярный объект в мировой аквариумистике. Цель работы – изучение влияния пробиотика субтилис-С, содержащего живые природные штаммы Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, на физиологическое состояние и клеточный иммунитет у дискусов и тиляпий. В лейкограмме дискусов, получавших пробиотик, отмечено значительное увеличение доли моноцитов, что свидетельствует об усилении неспецифической клеточной защиты (фагоцитоза). У тиляпий опытной группы в крови выявлено увеличение процентной доли лимфоцитов и появление эозинофилов и базофилов. Применение добавки пробиотика увеличивало у дискусов и тиляпий содержание катионного лизосомального белка в нейтрофилах крови, что свидетельствует об увеличении потенциальной фагоцитарной активности, повышающей способность организма противостоять инфекции и инвазии. Пробиотик повышал выживаемость икры и личинок у дискусов и оплодотворяемость икры у тиляпий. Заключили, что применение пробиотика способствует у рыб повышению резистентности к заболеваниям и показателей воспроизводства.

Введение
В условиях аквакультуры рыбы подвергаются воздействию стресс-факторов, связанных с интенсивным разведением: изменение температурного режима, гидрохимических параметров, увеличение плотности посадки, кормление концентрированными кормами, в которых преобладают ингредиенты наземного происхождения (Silveira-Coffigny et al., 2004).
Водная среда является хорошим субстратом для развития микроорганизмов, в т.ч. патогенных; в результате этого происходит снижение иммунитета культивируемых объектов (Martin, Krol, 2017).
Поэтому повышение общей резистентности у рыб в аквакультуре является актуальной задачей. Одним из путей усиления иммунной устойчивости организма является применение иммуномодуляторов.
Пробиотики являются эффективными и безопасными иммуномодуляторами, которые стимулируют выделение хемокинов эпителиальными клетками, привлекающих клетки врождённого иммунитета к эпителию и слизистой оболочке кишечника (Бондаренко, 2005; Забодалова, 2006). Благодаря выработке хемокинов и цитокинов происходит регуляция врождённого и приобретённого иммунного ответа (Shi et al., 2007; Харченко и др., 2015).

Наиболее популярными являются бактерии рода Bacillus в связи с их способностью к ферментативной активности и продуцированию значительного количества аминокислот, в том числе и незаменимых: треонин, глутаминовую кислоту, аланин, валин, тирозин, гистидин, орнитин (Смирнов и др., 1988).
Доказано, что уже на третьи сутки после введения спорообразующего пробиотика значительно снижается количество патогенной микрофлоры: Staphylococcus aureus и Escherichia сoli, а в последующие дни происходит полная элиминация их из организма (Осипова и др., 2005).
При попадании бактерий рода Bacillus в пищеварительный канал нормализуется
соотношение белковых фракций крови, вероятно, за счет активации синтеза специфических иммуноглобулинов (Сорокулова, 1996; Zhang et al., 2010).
Доказана активация индукции эндогенного интерферона при парентеральном введении культур бактерий рода Bacillus, а последние исследования выявляют подобный эффект и после перорального их введения (Скрыпник, Маслова, 2009).

Цихловые (дискусы, тиляпия) являются ценными культивируемыми видами: тиляпию используют как быстрорастущую, неприхотливую в выращивании товарную рыбу с высокими потребительскими качествами; дискус – популярный объект аквариумной аквакультуры. Кроме того, эти рыбы можно рассматривать как модельные объекты, демонстрирующие заботу о потомстве, позволяющие изучать физиологические механизмы размножения, выкармливания потомства и передачи ему иммунных свойств, а также для понимания эволюционных закономерностей развития колострального иммунитета (Привезенцев, 2011; Iq, Shu-Chien, 2011; Wen et al., 2018).

Исследования иммунных реакций у неклассических биомоделей (в т.ч. рыб) с успехом используются для открытия ранее неизвестных молекул и биохимических путей, участвующих в системах иммунитета у млекопитающих (Sunyer, 2013).
Использование сравнительных подходов позволяет получить информацию о том, как врожденный и адаптивный иммунитет совместно влияют на постоянно развивающиеся отношения между человеком, комменсальными организмами и микробными патогенами (Litman, Cooper, 2007).

Цель данной работы – изучение влияния пробиотика Субтилис-С, содержащего живые природные штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, на физиологическое состояние и клеточный иммунитет у дискусов (Symphysodon haraldi) и тиляпии (Oreochromis niloticus).

Материал и методы
Объектом исследования были половозрелые самцы и самки дискусов (Symphysodon haraldi) и тиляпии (Oreochromis niloticus). В опыте участвовало 18 пар (самцы и самки) дискусов (9 пар в контроле и 9 пар в опыте) и 8 пар тиляпий (4 пары в контроле и 4 в опыте). Взрослые дискусы содержались в 400 л. аквариумах с принудительной аэрацией и водоочисткой. Родительские пары дискусов содержались в 100-л. аквариумах; рыбы нерестились и выкармливали личинку до перехода на самостоятельное питание. Условия среды в аквариумах соответствовали нормам. Температура воды – 30±1°C, рН 6,0, фотопериод – по 12 ч. света и темноты, жёсткость 1-2 gH.
Кормом для дискусов служили личинки хирономид (Chironomus plumosus) 2,5% от массы тела. Кормление тиляпий осуществлялось комбикормом «Акварекс» 0,5% от массы тела. Рыбам опытной группы к корму добавлялся пробиотик «Субтилис-С» из расчёта 1 г/кг корма. Контрольные группы рыб (дискусов и тиляпий) получали корм без пробиотика.
Длительность эксперимента с дискусами и тиляпиями составляла 2 мес. В начале эксперимента самки тиляпии находились отдельно от самцов. Самки тиляпии по 8 голов на аквариум содержались в 600 л. аквариумах. Самцы находились в отдельных аквариумах индивидуально. Самцы и самки опытных групп получали пробиотик в качестве кормовой добавки. Через месяц от начала эксперимента самцы были подсажены к самкам (по одному самцу в каждый аквариум). После вынашивания личинку отбирали у самок и высаживали в отдельные емкости.
Температура воды в аквариумах поддерживалась на уровне 28±1°C, рН 8,3, фотопериод 14 ч. света и 10 ч. темноты, жёсткость 12 gH. По окончании опыта проводили исследования крови рыб, эпидермального секрета кормящих дискусов и ротовой слизи тиляпий, вынашивающих личинку. Кровь для анализа отбиралась у рыб прижизненно из хвостовой вены.
Мазки крови (по 2 шт. от каждой рыбы: один для лейкограммы, второй для цитохимической реакции определения катионного белка) изготовляли сразу после отбора крови. Эпидермальный секрет у кормящих самцов и самок дискусов получали in vivo спонжем, затем выдавливали в шприц (Chong et al., 2006). Ротовую слизь тиляпии получали также с помощью спонжа.
Физиолого-иммунологическая оценка рыб проводилась по гематологическим и цитохимическим показателям. Гематологические показатели лабильны и подвержены изменениям, в т.ч. сезонным. Соотношение иммунокомпетентных клеток (лейкоцитарная формула) отражает физиологическое состояние и иммунный статус рыб. Лейкоцитарная формула определялась методом дифференциального подсчёта в окрашенных по Паппенгейму мазках периферической крови. Уровень гемопоэза рыб определялся по доле незрелых форм эритроцитов и лейкоцитов.
Важным маркером иммунной устойчивости является цитохимический показатель кислород независимого фактора клеточного иммунитета. Неферментные катионные белки лизосом (дефенсины) обладают прямым киллерным действием на патогенны (Pronina, 2017; Chowdhury, 2020).
Фагоцитарная активность нейтрофилов рыб оценивалась с использованием лизосомально- катионного теста, адаптированного для гидробионтов, и цитохимического анализа с бромфеноловым синим (Пронина, 2014)
Определялось содержание неферментного катионного белка в лизосомах нейтрофилов периферической крови. По степени фагоцитарной активности исследуемые клетки делились на 4 группы: 0 – гранулы катионного белка отсутствуют; 1 – единичные гранулы; 2 – гранулы занимают примерно 1/3 цитоплазмы; 3 – гранулы занимают 1/2 цитоплазмы и более
Средний цитохимический коэффициент (СЦК) рассчитывали по формуле:

Анализ биохимических показателей крови является наиболее ценным современным методом исследования, поскольку было показано, что их физиологические значения являются видоспецифичными. Такие факторы, как: возраст, пол, условия окружающей среды и диета, могут существенно влиять на биохимические и гематологические показатели крови рыб (Patriche, 2011).

Для получения сыворотки кровь рыб набиралась шприцем в сухую пробирку. Пробирка с кровью оставлялась в штативе на 1 ч. при комнатной температуре. После образования сгустка крови сыворотка пастеровской пипеткой отделялась от образовавшегося сгустка и помещалась в холодильник при температуре +3°C на 3-5 ч. для завершения образования сыворотки. Затем сыворотка отсасывалась шприцом с тонкой иглой или пипеткой и переносилась в пробирку Эппендорфа. Для биохимического анализа сыворотка замораживалась при температуре – 28°C и транспортировалась в лабораторию в замороженном виде в термоконтейнерах. Биохимический анализ сыворотки крови проводили на приборе ChemWellAwarenesTechnology с использованием реактивов VITAL.
Лактоферрин в плазме крови рыб определяли методом иммуноферментного анализа. Кровь отбирали с гепарином на льду, в течение 20 мин. после сбора крови отделяли плазму центрифугированием при 1500 g и 4°C в течение 15 мин. Перенесённую в свежую полипропиленовую пробирку плазму центрифугировали, чтобы избежать контаминацию лейкоцитами (1500 g при 4°C в течение 15 мин.). Образцы хранились при температуре -70°C в полипропиленовых пробирках.
Результаты и обсуждение
Дискусы, получавшие и не получавшие пробиотик, не различались по массе тела. Субтилис- С не оказал влияния на показатели прироста и интенсивности роста рыб (табл. 1). По показателям эритропоэза у нерестящихся и кормящих дискусов существенных различий между группами не отмечено (табл. 1). Изменения в лейкоцитарной формуле под влиянием пробиотика у нерестящихся и кормящих дискусов показали, что иммуномодулятор активирует неспецифическую и специфическую резистентность. Доля моноцитов (макрофагов крови) у опытных дискусов более чем в два раза выше контроля. В лейкограмме дискусов опытной группы, в отличие от контрольных рыб, отсутствуют эозинофилы, что является физиологической нормой. Под действием пробиотика в крови нерестящихся и кормящих дискусов выявлено увеличение доли моноцитов.



Это согласуется с литературными данными (Dowidar et al., 2018; Шленкина и др., 2018).
Показано, что пробиотики в кишечнике активизируются и выделяют продукты метаболизма, которые модулируют активность иммунокомпетентных клеток, принадлежащих к неспецифическому барьеру: моноциты, макрофаги и нейтрофилы, а также слизеобразующие (бокаловидные) клетки. В результате стимуляции эти клетки выделяют антимикробные пептиды и синтезируют дефенсины (Rook et al., 2005; Аверина и др., 2015).
Выявлено, что пробиотики влияют на активность макрофагов рыб, увеличивая миграцию к местному повреждению и увеличивая их способность к фагоцитозу (Dias et al., 2020).

Результаты лизосомально-катионного теста показали, что кормление пробиотиком увеличило содержание цитотоксичного катионного белка в лизосомах нейтрофилов, на 0,25 ед (на 21%) что свидетельствует об усилении неспецифического клеточного иммунитета. Вероятно, данный факт связан со стимуляцией пробиотиком выработки дефенсинов (Бондаренко, 2005).

Применение пробиотика у дискусов снижает стрессовую реакцию и уменьшает процент пар дискусов, уничтожающих кладки (табл. 2). Выход икры у опытной группы дискусов был выше, чем в контроле на 10%; снятого малька – на 27% (P За время эксперимента у тиляпии произошло оплодотворение икры у 75% самок в опытной группе и 50% в контроле. По массе тела существенных различий в опыте и контроле у самок тиляпий не отмечено (табл. 3). В работах по изучению действия пробиотиков на рост и развитие нильской тиляпии описывались схожие результаты (Marzouk et al., 2015; Dowidar et al., 2018).



По интенсивности эритропоэза опытные и контрольные рыбы существенно не различались, что согласуется с данными, полученными другими исследователями, которые также не отмечали изменений в эритрограмме нильской тиляпии при использовании пробиотика (Dowidar et al., 2018).



Показатели лейкоцитарной формулы рыб в обеих группах не выходили за пределы референтных значений для рыб. В лейкограмме у тиляпий, получавших пробиотик, возросла доля лимфоцитов за счёт снижения незрелых форм миелоидного ряда; для палочкоядерных нейтрофилов различия статистически существенны, что, вероятно, свидетельствует об активации специфического звена иммунной защиты. Ряд авторов также отмечают увеличение доли лимфоцитов в лейкограмме рыб (клариевого сома – Clarias gariepinus) при использовании пробиотика Споротермин, содержащего штаммы Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (Шленкина и др., 2018).

В отличие от контроля, в крови у опытных тиляпий присутствует небольшой процент эозинофилов и базофилов, т.е. происходит усиление резистентности за счёт активации неспецифического звена клеточного иммунитета. Аналогичная тенденция в отношении базофилов отмечена у дискусов под влиянием пробиотика. Данные изменения повышают способность организма противостоять инфекции и инвазии.
Относительно клеточного иммунитета под влиянием пробиотика у тиляпий отмечаются изменения, аналогичные дискусам. В результате применения пробиотика увеличивается количество лизосомального катионного белка в нейтрофилах крови. Величина СЦК у тиляпий опытной группы была на 0,48 ед. (на 49%) выше, чем в контроле (Р В крови и эпидермальном секрете у дискусов, в крови и ротовой слизи у тиляпий впервые обнаружен лактоферрин. Выявлено, что пробиотик вызывает увеличение фермента в эпидермальном секрете кормящих дискусов за счет снижения его в крови (табл. 4).
Аналогичная тенденция отмечена и у тиляпий, вынашивающих личинку. Пробиотик вызвал увеличение содержание лактоферрина в ротовой слизи тиляпий и снижение фермента в крови. Увеличение уровня лактоферрина в кожном секрете кормящих пар дискусов, вероятно, усиливает иммунитет вскармливаемого потомства, что проявляется в повышении его выживаемости на личиночной стадии.



Известно, что лактоферрин продуцируется клетками миелоидного ряда в костном мозге и затем локализуется во вторичных гранулах зернистых нейтрофилов, где вместе с лизоцимом и щелочной фосфатазой входит в состав компонентов бактерицидной системы. Обнаружено, что объём лактоферрин-положительных секреторных гранул в незрелых клетках миелоидного ряда значительно больше, чем в зрелых полиморфно-ядерных лейкоцитах. Выявлено, что лактоферрин содержится в комплексе Гольджи и части выростов эндоплазматического ретикулума незрелых нейтрофилов на стадии ранних метамиелоцитов и миелоцитов (Baveye et al., 2000; Kuroda et al., 2015).

Заключение
Скармливание пробиотика субтилис-С не влияет на абсолютную и относительную скорость роста половозрелых дискусов и тиляпий. Применение пробиотика способствует активации фагоцитоза: увеличивается доля моноцитов в лейкограмме, однако субтилис-С не оказал влияния на количество моноцитов у тиляпий, так как у них значительно возросла доля лимфоцитов, т.е. произошла активация специфического звена клеточного иммунитета. Пробиотик вызывает увеличение лактоферрина в эпидермальном секрете кормящих дискусов за счёт снижения его в крови.
Субтилис-С повышает содержание катионного лизосомального белка в нейтрофилах крови у рыб семейства Цихловые, что свидетельствует о высокой потенциальной фагоцитарной актив- ности. В крови у цихлид при примениении пробиотика субтилис-С, присутствует небольшой процент эозинофилов и базофилов. Эти изменения повышают способность организма противо- стоять инфекции и инвазии. При применении пробиотика отмечено увеличение выживаемости икры и личинки у дискусов, а у тиляпий – оплодотворение икры.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 20-316-90028)


Список литературы

1. Аверина О.В., Ермоленко Е.И., Ратушный А.Ю., Тарасова Е.А., Борщев Ю.Ю., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А., Котылева М.П., Даниленко В.Н., Суворов А.Н. Влияние пробиотиков на продукцию цитокинов в системах in vitro и in vivo. // Медицинская иммунология. 2015. Т. 17. No 5. С. 443-454.

2. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Буданова Е.В. Доклинические испытания новых споровых пробиотиков. // Вестник РАМН. 2005. No 12. С. 36-40.

3. Привезенцев Ю.А. Тиляпии (биология, методы разведения и выращивания). М.: РГАУ-МСХА, 2011. 120 с.

4. Саная О.В. Влияние пробиотика-иммуномодулятора «Субтилис-С» на физиологическое состояние дискусов Symphysodon haraldi по биохимическим показателям. // Материалы Всероссийской научно- практической конференции с международным участием «Новейшие генетические технологии для
аквакультуры». Москва, 2020. М.: Изд. Перо, 2020. С. 346-349

5. Скрыпник И.Н., Маслова А.С. Современные спорообразующие пробиотики в клинической практике. //
Сучасна гастроентерологія. 2009. No 3. С. 81-90.

6. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. О некоторых механизмах возникновения
бессимптомной бактериемии. // Микробиологический журнал. 1988. Т. 50. No 6. С. 56-59.

7. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых
биопрепаратов. // Антибиотики и химиотерапия. 1996. Т. 41, No 10. С. 13-15.

8. Харченко Н. В., Чердынцева Т. А., Нетрусов А.И. Новые подходы для выделения штаммов
бифидобактерий, их молекулярная диагностика и оценка пробиотического потенциала. //
Микробиология. 2015. Т. 84. No 3. С. 1-8.

9. Шленкина Т.М., Романова Е.М., Мухитова М.Э. Влияние пробиотиков на лейкограмму африканского
клариевого сома в условиях индустриальной аквакультуры. // Вестник Ульяновской государственной
сельскохозяйственной академии. 2018. No 4 С. 222-228.

10. Baveye S., Elass E., Fernig D.G., Blanquart C., Mazurier J., Legrand D. Human lactoferrin interacts with soluble
CD 14 and inhibits expression of endothelial adhesion molecules, E-selectin and ICAM-1, induced by the CD14-
lypopolysaccharide complex. // Infection and Immunity. 2000. Vol. 68. nr12. P. 6519-6525.

11. Buckley J. Parental care and the development of the parent offspring conflict in discus fish (Symphysodon spp.).
School Biomed. Biol. Sci., 2011. 260 p.

12. Buckley J., Maunder R.J., Foey A., Pearce J., Val A.L., Sloman K.A. Biparental mucus feeding: a unique
example of parental care in an Amazonian cichlid. // J. Exp. Biol. 2010. Vol. 213. P. 3787-3795.

13. Chong, K., Shu-Chien A.C., Jin L.T., Joshi S Proteomics profiling of epidermal mucus secretion of a cichlid (Symphysodon aequifasciata) demonstrating parental care behavior. // Proteomics. 2006. Vol. 6. nr7. P. 2251-
2258.

14. Chowdhury G., Hossain Md.S., Dey T., Akhtar S., Jinia M.A., Das B., Islam Md. J., Iqbal M.M. Effects of
dietary probiotics on the growth, blood chemistry and stress response of Pabda catfish (Ompok pabda) juveniles.
// AACL Bioflux. 2020. Vol. 13. nr 3. P. 1595-1605.

15. Dias D. de C., Tachibana L., Iwashita M.K.P., Nakandakare I.B., Romagosa E., Seriani R., Ranzani-Paiva M.J.T.
Probiotic supplementation causes hematological changes and improves non-specific immunity in Brycon
amazonicus. // Acta Sci. Biol. Sci. 2020. Vol. 42. nr 1. P. 1-9.

16. Dowidar M., Azeem S., Khater A., Awad S., Metwally S. Improvement of growth performance, immunity and
disease resistance in Nile tilapia, Oreochromis niloticus, by using dietary probiotics supplementation. // J. Anim.
Sci. Vet. Med. 2018. Vol. 3. P. 35-46.

17. Grant K.R. Fish hematology and associated disorders. // Clin. Labor. Med. 2015. Vol. 35. nr 3. P. 681-701.

18. Hastuti S., Subandiyono S. Aminotransferase, hematological indices and growth of tilapia (Oreochomis
niloticus) reared in various stocking densities in aquaponic systems. // AACL Bioflux. 2020. Vol. 13. nr 2. P.
813-824.

19. Iq K.C., Shu-Chien A.Ch. Proteomics of buccal cavity mucus in female tilapia fish (Oreochromis spp.): a
comparison between parental and non-parental fish. // PLoS ONE. 2011. Vol. 6. nr 4. P. 1-7.

20. Irianto A., Austin B. Probiotics in aquaculture. // J. Fish Dis. 2001. Vol. 25. nr 11. Р. 633-642.

21. Jeronimo G.T., Laffitte L.V., Speck G.M., Martins M.L. Seasonal influence on the hematological parameters in
cultured Nile tilapia from southern. // Braz. J. Biol. 2011. Vol. 71. nr 35. P. 719-725.

22. Kuroda K., Okumura K., Isogai H., Isogai E. The human cathelicidin antimicrobial peptide LL-37 and mimics
are potential anticancer drugs. // Front. Oncol. 2015. Vol. 5. nr 1. P. 144-159.

23. Litman G.W., Cooper M.D. Why study the evolution of immunity? // Nat. Immunol. 2007. Vol. 8. P. 547-548.

24. Martin S.A.M., Krol E. Nutrigenomics and immune function in fish: new insights from omics technologies. //
Devel. Compar. Immun. 2017. Vol. 75. P. 86-98.

25. Marzouk M.S., Moustafa M.M., Nermeen M.M. The influence of some probiotics on the growth performance
and intestinal microbial flora of O. niloticus. // 8th International Symposium on Tilapia in Aquaculture. Cairo,
2008. P. 1059-1071.

26. Mattos D.C., Screnci-Ribeiro R., Cardoso L.D., Vidal Junior M.V. Description of the reproductive behavior of
Symphysodon aequifasciatus (Cichlidae) in captivity. // Acta Amazonica. 2016. Vol. 46. nr4. Р. 433-438.

27. Mesquita D.R., Porto J.I.R., Feldberg E. Chromosomal variability in the wild ornamental species of
Symphysodon (Perciformes: Cichlidae) from Amazon. // Neotrop. Ichthyol. 2008. Vol. 6. nr 2. P. 181-190.

28. Olmos J., Paniagua-Michel J. Bacillus subtilis a potential probiotic bacterium to formulate functional feeds for
aquaculture // Journal of Microbial and Biochemical Technology. 2014. Vol. 6(7). P. 361-365

29. Önal U., Çelik İ., Cirik Ş. Histological development of digestive tract in discus, Symphysodon spp. Larvae. //
Aquacult. Intern. 2010. Vol. 18. P. 589-601.

30. Patriche T., Patriche N., Bocioc E., Coada M.T. Serum biochemical parameters of farmed carp (Cyprinus
carpio). // AACL Bioflux. 2011. Vol. 4. nr 2. P. 137-140.

31. Pronina G.I. Physiological and immunological features of males and females of the immunologically resistant
carp breed (Cyprinus carpio L.). // AACL Bioflux. 2017. Vol. 10. nr 2. P. 335-340.

32. Pronina G.I., Koryagina N.Yu., Revyakin A.O., Stepanova O., Kurishenko Zh.O., Petrova N.V. Use of
hydrobionts as alternative biological models. // Neurosci. Behav. Physiol. 2019 Vol. 49. nr 5. P. 584-594.

33. Rook G., Blunet L. Microbes, immunoregulation, and the gut. // Gut. 2007. Vol. 54. P. 317-320.

34. Rossoni F., Amadio S., E. Ferreira, Zuanon J. Reproductive and population parameters of discus fish
Symphysodon aequifasciatus Pellegrin, 1904 (Perciformes: Cichlidae) from Piagaçu-Purus sustainable development reserve (RDS-PP), lower Purus River, Amazonas, Brazil. // Neotrop. Ichthyol. 2010. Vol. 8. nr 2. P. 379-383.

35. Satoh S., Tanoue H., Mohri M. Costs and benefits of biparental mucus provisioning in discus fish (Symphysodon aequifasciatus). // Ichthyol. Res. 2018. Vol. 65. P. 510-514.

36. Shi L., Qiu D., Zhao G., Corthesy B., Lees-Miller S., Reeves W., Kao P. Dynamic binding of Ku80, Ku70 and NF90 to the IL-2 promoter in vivo in activated T-cells. // Nucl. Acids Res. 2007. Vol. 35. P. 2302-2310.

37. Silveira-Coffigny R., Prieto-Trujillo A., Ascencio-Valle F. Effects of different stressors in haematological variables in cultured Oreochromis aureus S. // Comp. Biochem. Physiol. 2004. Vol. 139. nr 4. P. 245-250

38. Sunyer J.O. Fishing for mammalian paradigms in the teleost immune system. // Nature America. 2013. Vol. 14.
nr 4. P. 320-326.

39. Wen B., Jin S.-R., Chen Z.-Z., Gao J.-Z. Physiological responses to cold stress in the gills of discus fish. // Sci.
Total Environ. 2018. Vol. 640-641. P. 1372-1381.

40. Zhang Y.A., Salinas I., Li J., Parra D., Bjork S., Xu Z., LaPatra S.E., Bartholomew J., Sunyer J.O. IgT, a primitive
immunoglobulin class specialized in mucosal immunity. // Nat. Immunol. 2010. Vol. 11. nr 9. P. 827-835.


Сведения об авторах:

Пронина Галина Иозеповна, д.б.н. проф. 8(903)173-62-47. gidrobiont4@yandex.ru.

Саная Ольга Владимировна, м.н.с. 8(916)818-29-40. sanaya2020@list.ru.

Черкалин Алексей Игоревич, студ. 8(929)630-21-42. alexcherckalin@gmail.com.






Изменено 24.2.24 автор mocej

- Можно ли вылечить Гексамитоз (спиронуклеоз или октомитоз)?
- Есть авторитетные мнения, что дискусы являются носителями Гексамитоза от рождения и до смерти.
При правильном содержании, иммунитет подавляет развитие Гексамитоза. Усилия направленные на полное уничтожение заболевания, оканчиваются стерильностью дискусов.

- Можно ли адаптировать дискусов к более низким температурам, возможно постепенное понижение температуры в каждом новом поколении, позволяет это сделать?
- Нельзя. Этот путь прошли многие поколения аквариумистов.

- Какую температуру воды выбрали вы?
- Точность большинства бытовых термометров составляет ±3 градуса, реже ±2 градуса. Но любой термометр можно откалибровать, например по медицинскому термометру и вносить поправку на погрешность.
По точному поверенному термометру я считаю оптимальной температуру воды в +31С, именно при такой температуре, по моему мнению, дискусы наиболее активные, красочные и меньше подвержены заболеваниям.

- Что делать при первых симптомах, указывающих на какое либо заболевание? Существуют ли профилактические меры? Нужен ли карантин новым рыбам?
- Лучшая профилактика и первая реакция аквариумиста на тревожные сигналы, по моему мнению, это повышение температуры до +34С смело и до +36С с постоянным наблюдением, при постоянной активной аэрации (кроме бактериалки, "азиатки"). Карантин как таковой я не понимаю, вы купили рыб, посадили их в карантинный аквариум который как минимум не такой же как постоянный, чем вызвали дополнительный стресс после транспортировки. После карантина вы поместили рыб в постоянный аквариум, чем вызвали еще один стресс. Рыбы без видимых симптомов заболеваний в карантинном аквариуме, могут заболеть и заразить рыб в постоянном аквариуме. Считаю правильным единовременное заселение пустого подготовленного аквариума сразу полным составом населения, без дополнений.

Конец.


Изменено 24.2.24 автор mocej

Моя школа.












Изменено 25.2.24 автор mocej